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磷酸化蛋白富集试剂盒

产品编号: BB-3108

产品系列: 蛋白提取试剂盒

  • 产品描述

  •  

    注：
    ● 蛋白裂解液： 含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白
    防止沉淀。
    ● 蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂混合物：包含AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、
    Cantharidin、Microcystin LR、Bromotetramisole。
    注意：
    1、蛋白样品中不可含 EDTA。
    2、蛋白酶抑制剂混合物避免反复冻融。
    3、如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    4、每个柱的载量约为 1mg 磷酸化蛋白。
    储存条件：
    蛋白酶磷酸酶抑制剂-20℃保存；其它2-8℃保存。蛋白柱室温避光保存。
    有效期：
    一年。
    注意事项：
    ● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
    ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
    ● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
    ● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
    ● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。
    产品简介：
    我公司磷酸化蛋白富集试剂盒是利用磷酸基团与金属的亲和力，采用固定化金属螯合层析（IMAC）的方法富集磷酸化蛋白。可以选择性的对磷酸化蛋白和多肽进行富集和纯化。本试剂盒可以用来提取富集哺乳动物细胞、组织、细菌、酵母、植物等样本的的磷酸化蛋白。经本试剂盒制备的蛋白样品可用于Western blotting, mass spectrometry, 2D-PAGE和protein arrays 等下游应用。
    试剂盒以外自备试剂和仪器
    ● 移液器、吸头 ● 离心机及离心管
    ● 涡旋振荡器 ● 冰箱，冰盒
    使用方法：
    使用注意事项：
    1. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
    2. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
    3. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
    4. 蛋白样品中不可含 EDTA。
    5. 上样蛋白样品 pH 值必须低于6，蛋白浓度在0.25-0.5mg/ml。
    6. 洗涤细胞和组织是不能用 PBS 等磷酸盐缓冲液，要用非磷酸盐缓冲液，如50mM HEPES，Tris等或生理盐水。
    7. 可以根据自己实验需要加入其它磷酸酶抑制剂单品。
    8. 用蛋白柱进行磷酸化蛋白富集，需要离心操作时将蛋白柱置于一个 50ml 离心管离心即可。
    9. 最终蛋白样品用于 2D 电泳前需脱盐。
    一、蛋白样品的准备：
    以下为由细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤，其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25-0.5mg/ml 后直接上样即可，确保蛋白样品的pH 值低于6。可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。
    细胞裂解：
    1. 提取液制备：每 500ul 冷的裂解液中加入2ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    2. 取 5-10×106 个细胞，在4℃，1000rpm 条件下离心5-10 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
    3. 用冷生理盐水洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
    4. 每 5×106个细胞中加入500ul 冷的蛋白裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15-20分钟。
    5. 在 4℃，14000rpm 条件下离心15 分钟。
    6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。
    组织裂解：
    1. 提取液制备：每 500ul 冷的裂解液中加入2ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    2. 取 100mg 组织样本剪碎，加入总蛋白提取液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
    3. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃，10000rpm 条件下离心5 分钟。
    4. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。
    植物蛋白提取：
    1、裂解液制备：每500ul 冷的提取液中加入2ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。
    2、取 200mg 植物组织样本，去除粗筋脉络等后剪碎，置于研钵中用液氮研磨。（没有液氮也可直接置冰上研磨即可）
    3、研磨后加入 500ul 提取液，混匀后于一个预冷的干净离心管中在冰上静置2-3小时。
    4、在 4℃，12000rpm 以上条件下离心10-15 分钟。
    5、将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
    细菌蛋白提取：
    注：细菌中磷酸化蛋白量较少，请根据样本情况调整所需的样本量。经过基因工程改造的可以直接合成表达磷酸化蛋白的细菌样本，根据情况处理细胞，不一定按下面的步骤。
    1、裂解液制备：每500ul 冷的提取液中加入2ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。
    2、在 4℃ 12000RPM 条件下将菌液离心5min，弃上清，尽量吸干剩余液体，收集菌体，用生理盐水洗菌体2 次。若为冷冻菌体直接进行下面操作步骤即可。
    3、按每 20mg 湿重菌体样本加入500ul 裂解液，吹打混匀，冰上放置20-30 分钟。
    4、300w，10s 超声/10s 间隔条件下冰浴超声至菌液变清。
    5、在 4℃ 12000RPM 条件下将菌液离心5 分钟，将上清移入冷的干净离心管。
    6、即得到细菌总蛋白样品。
    二、柱平衡：
    加入 500ul 洗柱液洗柱，重力作用下或4℃下1000g 力离心1 分钟甩干吸附柱。
    三、上样：
    将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱，重力作用下或4℃下1000g
    力离心1 分钟甩干吸附柱。
    四、洗柱：
    加入 300ul 洗涤液洗柱，重力作用下或4℃下1000g 力离心1 分钟甩干吸附柱。重
    复两次。
    五、洗脱：
    加入 500ul 磷酸化蛋白洗脱液，重力作用下或4℃下1000g 力离心1 分钟甩干吸附柱，收集洗脱液，即得到磷酸化蛋白。
    六、柱保存和柱再生：
    磷酸化蛋白纯化柱如果保存和处理得当的话可以多次重复使用。
    使用后可以用 1ml 0.1M EDTA 溶液洗柱，然后在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2-8℃保存。
    加入 0.1M 氯化铁溶液，浸泡蛋白柱填料，即可对蛋白柱进行再生。

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植物核蛋白/胞质蛋白提取试剂盒

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膜/胞浆/核蛋白分步提取试剂盒

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